1. 如何開發(fā)高選擇性去泛素化酶（DUB）化學(xué)探針？

去泛素化酶（DUBs）在細胞內(nèi)負責(zé)移除蛋白質(zhì)上的泛素修飾，在病毒感染、神經(jīng)退行性疾病及癌癥等多種病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是具潛力的治療靶點。人類基因組編碼約100種DUB，然而目前缺乏能夠特異性識別并表征其活性的化學(xué)工具，限制了在生理與病理條件下對其功能的研究。盡管商品化的廣譜熒光底物（如C端泛素序列或熒光標記泛素分子）已廣泛應(yīng)用于DUB的生化分析，但仍亟需開發(fā)能夠針對單個DUB的高選擇性探針。

2. 如何利用非天然氨基酸篩選DUB的底物偏好？

來自波蘭弗羅茨瓦夫理工大學(xué)的Marcin Drag教授和Wioletta Rut教授團隊在Chemical Science上發(fā)表了一項研究，致力于構(gòu)建基于泛素（Ub）支架的高選擇性DUB化學(xué)探針。該策略的核心是將非天然氨基酸引入保守的C端Ub序列，以系統(tǒng)篩選DUB的底物識別偏好。

研究以兩種重要的癌癥相關(guān)DUB——MERS PLpro和UCH-L3為模型，構(gòu)建了兩類化學(xué)底物文庫：一類用于篩選P2位點偏好（Ac-Leu-Arg-P2-Gly-ACC），另一類為混合底物文庫，用于評估P3和P4位點的特異性。篩選結(jié)果顯示，MERS PLpro在P2位點偏好甘氨酸，而UCH-L3更傾向脂肪族氨基酸；在P3位點，UCH-L3強烈偏好精氨酸，MERS PLpro則更接受疏水性殘基。基于這些特異性圖譜，作者合成了相應(yīng)底物，并經(jīng)由動力學(xué)實驗驗證了其高選擇性。

3. 能否構(gòu)建具有選擇性的泛素基不可逆探針？

在明確底物特異性的基礎(chǔ)上，作者進一步設(shè)計了基于Ub的活性探針。這些探針在N端引入檢測標簽（如生物素），C端則嫁接不可逆親電基團——乙烯基甲基酯（VME），該集團可廣泛與DUB活性位點共價結(jié)合。

酶動力學(xué)分析表明，所構(gòu)建的B-Ub-UCHL3-2-VME和B-Ub-MERS27-VME分別對UCH-L3和MERS PLpro表現(xiàn)出高效和特異性標記能力，其效果優(yōu)于野生型Ub-ACC底物。后續(xù)在細胞裂解液中的實驗進一步證實了這些探針具有良好的選擇性和細胞活性。

4. 該策略是否為DUB研究提供通用化工具開發(fā)平臺？

本研究通過將非天然氨基酸嵌入泛素分子框架，成功開發(fā)出一套活性與選擇性兼具的DUB化學(xué)探針構(gòu)建策略。該方法不僅適用于UCH-L3和MERS PLpro，更具潛力推廣至其他DUB及泛素類似特異性蛋白酶的研究中，為探索DUB在疾病中的作用機制及開發(fā)靶向療法提供了強有力的化學(xué)工具。